Starpība starp gēnu klonēšanu un PCR

Galvenā atšķirība - gēnu klonēšana vs PCR
 

Daudzu DNS kopiju sintēzi no noteikta DNS fragmenta sauc par DNS amplifikāciju. Ir divi galvenie DNS amplifikācijas procesi, proti, gēnu klonēšana un PCR. Galvenā atšķirība starp gēnu klonēšanu un PCR ir, gēnu klonēšana rada vairākas konkrēta gēna kopijas in vivo konstruējot rekombinanto DNS un audzējot baktēriju saimniekdatorā, kamēr PCR iegūst miljoniem specifiska DNS fragmenta kopiju in vitro veicot atkārtotus denaturācijas un sintēzes ciklus.

SATURS
1. Pārskats un galvenās atšķirības
2. Kas ir gēnu klonēšana
3. Kas ir PCR
4. Salīdzinājums blakus - gēnu klonēšana vs PCR
5. Kopsavilkums

Kas ir gēnu klonēšana?

Gēnu klonēšana ir paņēmiens, ko izmanto, lai lokalizētu un pavairotu noteiktu gēnu no ekstrahētā organisma genoma DNS, veidojot rekombinanto DNS. Genomiskajā DNS ir tūkstošiem dažādu gēnu, kas kodēti olbaltumvielām. Kad ekstrahē DNS, tas ietver visus iespējamos gēnus, ko tas var nest. Gēnu klonēšanas tehnika ļāva noteikt noteiktu gēnu no kopējā DNS. Tāpēc gēnu klonēšana kalpo par svarīgu instrumentu molekulārajā bioloģijā.

Gēna klonēšanā ir svarīgi izveidot organisma genoma bibliotēku, ja nav ne jausmas par attiecīgā gēna atrašanās vietu DNS. Genoma bibliotēka tiek izveidota, veicot šādas darbības.

1. darbība: Kopējās DNS ekstrahēšana no organisma, kas satur vēlamo gēnu.

2. darbība: Ekstrahētās DNS sagremošanas ierobežošana, lai iegūtu mazus apstrādājamus fragmentus. Šo soli atvieglo restrikcijas endonukleāzes.

3. darbība: Piemērota vektora atlase un vektora DNS atvēršana, izmantojot tās pašas restrikcijas endonukleāzes. Baktēriju plazmīdas parasti izmanto kā vektorus svešas DNS pārnēsāšanai. Plazmīdas ir mazi DNS apļi, kas atrodas baktērijās.

4. darbība: Vektora DNS un sadrumstalota DNS apvienošana, lai iegūtu rekombinantās DNS molekulu. Šo soli pārvalda DNS ligase.

5. darbība: Rekombinanto DNS molekulu pārnešana baktērijās. Šis solis ir pazīstams kā transformācija, un to veic, izmantojot karstuma triecienu.

5. darbība: Transformēto baktēriju šūnu skrīnings uz barotnes. Transformācijas procesa beigās tiek iegūta jaukta transformētu un netransformētu saimnieka šūnu populācija. Tā kā interesējošais gēns ietver tikai pārveidotās saimnieka šūnas. Tāpēc ir jāizvēlas pārveidotās šūnas. Atlase tiek veikta, izmantojot selektīvos barotnes, kas satur antibiotikas. Šajā skrīninga vidē aug tikai pārveidotās šūnas, kas ļauj atlasīt.

6. darbība: Baktēriju audzēšana, lai iegūtu gēnu bibliotēku. Šajā posmā pārveidotās saimnieka šūnas ievada svaigā barotnē, kas nodrošina optimālas augšanas prasības. Kopējās kolonijas uz kultūras plāksnēm atspoguļo šī organisma genoma bibliotēku.

7. darbība: Rekombinantās DNS molekula, kas satur interesējošo gēnu, jāizmeklē no tūkstošiem rekombinantās DNS klonētu fragmentu. To var panākt, izmantojot zondes, kas iezīmē specifisko gēnu vai no šī gēna rodas specifiski proteīni.

Kad interesentais gēns, kas satur baktēriju koloniju, ir identificēts no visām kolonijām, ir iespējams izgatavot miljonus rekombinantās plazmidijas kopiju, kas satur gēnu.

Gēnu klonēšanu izmanto, veidojot gēnu bibliotēkas, ražojot īpašus proteīnus, vitamīnus, antibiotikas, hormonus, secējot un kartējot organismu genomus, padarot indivīdu DNS vairākas kopijas kriminālistikā utt..

Attēls_1: gēnu klonēšana

Kas ir PCR?

Polimerāzes ķēdes reakcija (PCR) ir paņēmiens, ar kuru tiek ģenerēts liels skaits noteikta DNS fragmenta kopiju. Specifiskas DNS sekvences eksponenciālu amplifikāciju iegūst ar PCR saskaņā ar in vitro nosacījumus. Šis paņēmiens ir ļoti spēcīgs molekulārās bioloģijas rīks, jo tas var reizināt nelielu DNS paraugu izmantojamā daudzumā. PCR ieviesa Kary Mullis 1983. gadā, un šis godalgotais izgudrojums radīja milzīgu progresu molekulārajā bioloģijā.

PCR paņēmiens seko atkārtotām PCR reakcijām, kā parādīts 02. attēlā. Viena PCR reakcija sastāv no trim galvenajiem posmiem, kas notiek trīs dažādās temperatūrās; divkāršās stieples denaturēšana pie DNS 94 ⁰C, gruntējumu atkvēlināšana 68 ° C temperatūrā ⁰C un virknes pagarinājums 72 ° C temperatūrā ⁰C. Tāpēc, veicot PCR, pareizai replikācijai ir ļoti jāsaglabā temperatūras svārstības. PCR veic PCR mašīnā PCR mēģenēs. PCR mēģenes tiek ielādētas ar pareiziem PCR maisījumiem, kas satur matricas DNS, Taq polimerāzi, praimerus, dNTP un buferšķīdumu. Divvienkāršā parauga DNS denaturēšana vienpavediena DNS tiek veikta, sadalot ūdeņraža saites starp komplementārām bāzēm pie 94 - 98 ⁰C. Tad atsevišķas šablona DNS šķipsnas tiek pakļautas praimeriem. Jāiesniedz pāris grunti (uz priekšu un atpakaļ), un tiem jābūt termostabiliem, lai izturētu augstu temperatūru. Praimeri ir vienas virknes īsas DNS sekvences, kas papildina mērķa DNS fragmenta galus. PCR tiek izmantoti sintētiskie grunti. Praimeri saistās ar parauga DNS komplementārajām bāzēm un sāk jaunas virknes sintēzi. Šo soli katalizē enzīms, ko sauc par Taq polimerāzi; termostabils DNS polimerāzes enzīms, kas izolēts no Thermus auqaticus. Kad ir pieejami grunti un nukleotīdi (celtniecības bloki), Taq polimerāze konstruē jauno DNS virkni, kas papildina matricas DNS. PCR programmas beigās tiek novērots amplificēts DNS fragments, izmantojot gēla elektroforēzi. Ja nepieciešama papildu analīze, PCR produktu attīra no gēla.

PĶR ir ļoti noderīga ģenētisko un iegūto slimību diagnosticēšanai un uzraudzībai, noziedznieku identificēšanai (kriminālistikas jomā), mērķa DNS segmenta struktūras un funkcijas izpētei, organismu genomu secībai un kartēšanai utt. parasts laboratorijas paņēmiens medicīnas un molekulārās bioloģijas pētījumu laboratorijās zinātnieku vidū, jo tam ir plašs pielietojums.

Attēls2: Polimerāzes ķēdes reakcija

Kāda ir atšķirība starp gēnu klonēšanu un PCR?

Gēna klonēšana vs PCR
Gēnu klonēšana ir process, kurā tiek izgatavotas vairākas konkrēta gēna kopijas in vivo caur rekombinanto DNS un pārveidojot par saimnieka baktēriju.	PCR paņēmiens rada vairākas noteiktas DNS sekvences kopijas in vitro izmantojot atkārtotus PCR reakciju ciklus.
Prasība izveidot rekombinanto DNS
Gēna lokalizēšanai tiek ražota rekombinantā DNS.	Rekombinantā DNS netiek ražota.
Nepieciešamība pēc darba
Šis process prasa daudz darba.	Intensīvs darbs nav nepieciešams.
In vivo vai in vitro process
Rekombinantās DNS konstruēšana ir in vitro un DNS amplifikācija ir in vivo.	DNS pastiprināšanās notiek pilnībā in vitro.

Kopsavilkums - gēnu klonēšana vs PCR

Gēnu klonēšana un PCR ir divas metodes, ko izmanto DNS amplifikācijā. PCR ir in vitro process, kurā tiek izgatavotas vairākas konkrēta DNS fragmenta DNS kopijas, neizmantojot rekombinanto DNS un saimnieka organismu. Gēnu klonēšana galvenokārt ir in vivo process, kura rezultāts ir vairākas ieinteresētā gēna kopijas saimniekorganismā, veidojot rekombinanto DNS. Šī ir atšķirība starp gēnu klonēšanu un PCR.

Atsauce:
1. Grifits, Entonijs JF. “Konkrēta gēna klonēšana.” Mūsdienu ģenētiskā analīze. ASV Nacionālā medicīnas bibliotēka, 1999. gada 1. janvāris. Tīmeklis. 2017. gada 22. februāris
2. “Polimerāzes ķēdes reakcija (PCR).” Nacionālais biotehnoloģijas informācijas centrs. ASV Nacionālā medicīnas bibliotēka, n.d. Web. 2017. gada 22. februāris

Attēla pieklājība:
1. CNX OpenStax - (CC BY 4.0) - “Attēls 17 01 06”, izmantojot Commons Wikimedia
2. Madprime “PCR” - paša darbs (CC BY-SA 3.0), izmantojot Commons Wikimedia