Atšķirība starp Maksamu Gilbertu un Sangeru secību

Galvenā atšķirība - Maksams Gilberts pret Sangeru secību
 

Nukleotīdi ir DNS pamatkonstrukcijas un celtniecības bloki. DNS molekula sastāv no polinukleotīdu ķēdes. DNS ir atrasti četri dažādi nukleotīdi. Šie nukleotīdi sastāv no četrām dažādām slāpekļa bāzēm ar nosaukumu A (adenīns), G (guanīns), C (citozīns), T (timīns). Nukleotīdu secībai DNS molekulā ir liela nozīme, jo tā kodē svarīgu ģenētisko informāciju organismu augšanai un attīstībai. DNS sekvencēšana attiecas uz procesu, kas nosaka precīzu DNS nukleotīdu secību. Ir dažādas DNS secības metodes. Maksama Gilberta sekvencēšana un Sangera DNS sekvencēšana ir divas DNS sekvencēšanas metodes, kas pieder pie pirmās paaudzes sekvencēšanas. Maksima Gilberta sekvencēšanas procedūra nosaka bāzes secību, ķīmiski sadalot 5'-galu marķētos DNS fragmentus, vēlams katrā no četriem nukleotīdiem un gēla elektroforēzi. Sangera sekvencēšanas procedūra nosaka nukleotīdu secību, sintezējot vienpavediena DNS, izmantojot DNS polimerāzi un dideoksinukleotīdus un gēla elektroforēzi. Šī ir galvenā atšķirība starp Maksamu Gilbertu un Sangeru Sequencingu.

SATURS
1. Pārskats un galvenās atšķirības
2. Kas ir Maxam Gilbert
3. Kas ir Sangera sekvencēšana
4. Blakus salīdzinājums - Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
5. Kopsavilkums

Kas ir Maxam Gilbert secība?

Maxam Gilbert secība, kas pazīstama arī kā ķīmiskās secības metode, ir metode, kas tika izstrādāta, lai noteiktu nukleotīdu secību DNS. Šo metodi 1976. gadā ieviesa Valters Gilberts un Alans Maksams, un tā kļuva populāra, jo to var veikt tieši ar attīrītu DNS. Maksama Gilberta metode pieder pie pirmās DNS paaudzes secības noteikšanas, un tā bija pirmā sekvencēšanas metode, ko plaši izmantoja zinātnieki.

Šīs metodes pamatprincips ir ar galu iezīmētu DNS fragmentu ierobežošana ar specifiskām bāzēm ar bāzei specifiskām ķīmiskām vielām un nosacījumiem, kā arī marķēto fragmentu atdalīšana ar elektroforēzi, kā parādīts 01. attēlā. Fragmenti tiek atdalīti atbilstoši to lielumam uz želeja. Tā kā fragmenti ir marķēti, DNS molekulas secību var viegli secināt.

Maksamā Džilberta metodē tiek izmantotas pamata ķimikālijas, lai sadalītu DNS noteiktā bāzē. Purīnu un pirimidīnu selektīvai iedarbībai tiek izmantotas divas izplatītas ķīmiskās vielas - dimetilsulfāts un hidrazīna ķīmiskās vielas..

Maksima Gilberta secības metodi veic vairākos posmos šādi.

1. DNS sekvences attīrīšana, izmantojot restrikcijas endonukleāzes
2. DNS fragmentu galu marķēšana, pievienojot radioaktīvos fosfātus
3. Marķēto fragmentu attīrīšana no nemarķētajiem fragmentiem ar gēla elektroforēzi
4. Ar galu iezīmētās DNS atdalīšana četrās mēģenēs un apstrāde ar bāzei specifiskām ķīmiskām vielām atsevišķi
5. Katras mēģenes satura elektroforēze uz atsevišķām līnijām uz gela un fragmentu atdalīšana atbilstoši to garumam.
6. Fragmentu noteikšana ar autoradiogrāfu.

01. attēls. Maksima Gilberta secība

Kas ir Sangera sekvencēšana?

Sangera sekvencēšana ir sekvencēšanas metode, kuru 1977. gadā izstrādāja Frederiks Sangers un viņa kolēģi, lai noteiktu dotā DNS fragmenta bāzes secību. To sauc arī par ķēdes izbeigšanas secība vai Dideoksi secības metode. Šī metode darbojas pēc principa, kurā DNS polimerāze selektīvi iekļauj virkni, kas izbeidz DNS diferenciālus (ddNTP), piemēram, ddGTP, ddCTP, ddATP un ddTTP, sintēzes laikā vienpavediena DNS, lai pārtrauktu virknes veidošanos. Dideoksinukleotīdiem trūkst 3 'OH grupu fosfodiestera saišu veidošanai ar blakus esošo nukleotīdu. Tādējādi dzīslu veidošanās apstājas, tiklīdz ddNTP ir iestrādāts tikko veidojošajā virknē, veicot smalcināšanas secību.

Šajā metodē četrās atsevišķās mēģenēs ar viena veida ddNTP tiek veiktas četras atsevišķas DNS sintēzes reakcijas (PCR). PCR mēģenēm tiek piegādātas arī citas prasības, ieskaitot gruntis, dNTP, Taq polimerāzi, īpašus apstākļus utt. Četras atsevišķas reakcijas tiek veiktas četrās mēģenēs ar četriem maisījumiem. Pēc PCR reakcijām iegūtie DNS fragmenti tiek termiski denaturēti un atdalīti ar gēla elektroforēzi. Tad fragmentus vizualizē, izmantojot vai nu marķētu (radioaktīvu vai fluorescējošu) grunti, vai dNTP, kā parādīts 02. Attēlā..

02 attēls: Sanger secība

Kāda ir atšķirība starp Maksamu Gilbertu un Sangeru Sequencingu?

Maxam Gilbert vs Sanger secība
Maksams Gilberts sekvencēšana ir pirmais paņēmiens, kas izstrādāts DNS sekvenēšanai.	Sangera sekvencēšanas metode tika ieviesta pēc Maxam Gilbert sekvencēšanas metodes.
Lietošana
Šo metodi izmanto reti.	Sangera secību parasti izmanto secībai.
Bīstamo ķīmisko vielu lietošana
Tajā tiek izmantotas bīstamas ķīmiskas vielas.	Bīstamo ķīmisko vielu izmantošana ir ierobežota, salīdzinot ar Maksama Gilberta metodi.
Marķēšana noteikšanai
Šajā metodē izmanto radioaktīvo P32 DNS fragmentu galu marķēšanai.	Sangera secībā tiek izmantoti radioaktīvi vai ar fluorescējoši marķēti ddNTPs.

Kopsavilkums - Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing

Maksams Gilberts un Sangers sekvencēšana ir divu veidu DNS sekvencēšanas paņēmieni, uz kuriem attiecas pirmās paaudzes DNS sekvencēšana. Maksama Gilberta sekvencēšana ir pirmā metode, ar kuru DNS sekvencē ieviesa 1976. gadā, un to veic, sadalot gala marķētos DNS fragmentus ar bāzei specifiskām ķīmiskām vielām. Tāpēc to sauc par ķīmisko secību. Sangera sekvencēšanas metode tika ieviesta 1977. gadā, un tā ir balstīta uz ddNTP vadītajām ķēdes izbeigšanas reakcijām. Sangera sekvencēšanas metode, kas ir populāra nekā Maksamā Džilberta metode, pateicoties vairākiem Maksamā Žilberta metodes trūkumiem, piemēram, pārmērīgam laika patēriņam, bīstamu ķīmisku vielu izmantošanai utt. Šī ir atšķirība starp Maksamu Gilbertu un Sangeru secību..

Atsauces:
1.Maksāms, A.M. un Valters Gilberts. “Jauna metode DNS secības noteikšanai.” Nacionālās zinātņu akadēmijas raksti. National Acad Sciences, 1976. gada 9. decembris. Web. 2017. gada 30. marts
2.Heather, James James un Benjamin Chain. "Sekvenieru secība: DNS sekvencēšanas vēsture." Genomika. Academic Press, 2016. gada janvāris. Web. 2017. gada 30. marts
3.Pareek, Chandra Shekhar, Rafal Smoczynski un Andrzej Tretyn. “Sekvenēšanas tehnoloģijas un genoma sekvencēšana.” Lietišķās ģenētikas žurnāls. Springer-Verlag, 2011. gada novembris. Web. 2017. gada 30. marts

Attēla pieklājība:
1. “Maxam gilbert secība”, vairākas reizes izveidojusi angļu Vikipēdijā (CC BY 3.0), izmantojot Commons Wikimedia
2. Estevezj “Sanger sekvencēšana” - pašu darbs (CC BY-SA 3.0), izmantojot Commons Wikimedia