Atšķirība starp Sanger secību un Pirosequencing

Galvenā atšķirība - Sanger secība vs pirosequencing
 

DNS secība ir ļoti svarīga DNS analīzei, jo zināšanas par pareizu nukleotīdu izvietojumu noteiktā DNS reģionā atklāj daudz svarīgas informācijas par to. Ir dažādas DNS secības metodes. Sangera sekvencēšana un pirosekvenēšana ir divas dažādas DNS secības metodes, ko plaši izmanto molekulārajā bioloģijā. Galvenā atšķirība starp Sanger sekvencēšanu un Pyrosequencing ir tā Sangera sekvencē tiek izmantoti dideoksinukleotīdi, lai izbeigtu DNS sintēzi, lai nolasītu nukleotīdu secību, savukārt pirosekvenēšana nosaka pirofosfāta izdalīšanos, iestrādājot nukleotīdus un sintezējot komplementāro secību, lai nolasītu precīzu secības secību..

SATURS
1. Pārskats un galvenās atšķirības
2. Kas ir Sangera sekvencēšana
3. Kas ir pirosequencing
4. Salīdzinājums blakus - Sangera secība salīdzinājumā ar pirosequencing
5. Kopsavilkums

Kas ir Sangera sekvencēšana?

Sangera sekvencēšana ir pirmās paaudzes DNS sekvencēšanas metode, kuru 1977. gadā izstrādāja Frederiks Sangers un viņa koledžas. To sauc arī par Ķēdes izbeigšanas secība vai Dideoksi secība jo tā balstās uz dideoksinukleotīdu (ddNTP) ķēdes izbeigšanu. Šī metode tika plaši izmantota vairāk nekā 30 gadus, līdz tika izstrādāta jaunās paaudzes sekvencēšana (NGS). Sangera sekvencēšanas tehnika ļāva atklāt pareizu nukleotīdu secību vai piestiprināt noteiktu DNS fragmentu. Tā pamatā ir selektīva ddNTP pievienošana un DNS sintēzes pārtraukšana in vitro DNS replikācija. 3 'OH grupu neesamība, lai turpinātu fosfodiestera saites veidošanos starp blakus esošajiem nukleotīdiem, ir unikāla ddNTP īpašība. Līdz ar to, kad ddNTP ir pievienots, ķēdes pagarinājums apstājas un beidzas no šī punkta. Sangera secībā tiek izmantoti četri ddNTPs - ddATP, ddCTP, ddGTP un ddTTP. Šie nukleotīdi pārtrauc DNS replikācijas procesu, kad tie ir iestrādāti augošajā DNS virknē, un to rezultāts ir dažāda garuma īss DNS. Kapilārā gela elektroforēzi izmanto, lai šos īsos DNS virzienus sakārtotu pēc to lieluma uz gela, kā parādīts 01. attēlā..

1. attēls: sintezētas īsās DNS kapilārā gēla elektroforēze

Priekš in vitro DNS replikācija, būtu jāparedz dažas prasības. Tie ir DNS polimerāzes enzīms, DNS matricas, oligonukleotīdu praimeri un dezoksinukleotīdi (dNTP). Sangera secībā DNS replikāciju veic četrās atsevišķās mēģenēs kopā ar četriem ddNTP tipiem. Dezoksinukleotīdi nav pilnībā aizstāti ar attiecīgajiem ddNTP. Konkrētā dNTP maisījums (piemēram, dATP + ddATP) tiek iekļauts mēģenē un atkārtots. Četrus atsevišķus mēģenes izstrādājumus darbina uz želejas četrās atsevišķās iedobēs. Pēc tam, nolasot želeju, secību var izveidot, kā parādīts 02. Attēlā.

02 attēls: Sanger secība

Sangera sekvencēšana ir svarīgs paņēmiens, kas palīdz daudzās molekulārās bioloģijas jomās. Cilvēka genoma projekts tika veiksmīgi pabeigts ar Sangera sekvencēšanas metožu palīdzību. Sangera sekvencēšana ir noderīga arī mērķa DNS secībā, vēža un ģenētisko slimību pētījumos, gēnu ekspresijas analīzē, cilvēka identificēšanā, patogēnu noteikšanā, mikrobu secībā utt..

Sangeru secībai ir vairāki trūkumi:

• Sekvenētās DNS garums nedrīkst būt garāks par 1000 bāzes pāriem
• Vienlaicīgi var secēt tikai vienu virkni.
• Process ir laikietilpīgs un dārgs.

Tāpēc, lai pārvarētu šīs problēmas, laika gaitā tika izstrādātas jaunas uzlabotas secības noteikšanas metodes. Tomēr Sangera sekvencēšana joprojām tiek izmantota, pateicoties tās ļoti precīziem rezultātiem līdz aptuveni 850 bāzes pāra garuma fragmentiem.

Kas ir pirosequencing?

Pirozequencing ir jauna DNS sekvencēšanas metode, kuras pamatā ir “sintezēšana ar sintēzes palīdzību”. Šis paņēmiens balstās uz pirofosfāta izdalīšanās noteikšanu pēc nukleotīda pievienošanas. Procesu izmanto četri dažādi fermenti: DNS polimerāze, ATP sulfurilāze, luciferāze un apirāze un divi substrāti adenozīna 5 ’fosfosulfāts (APS) un luciferīns.

Process sākas ar praimeru saistīšanu ar vienšūnas DNS šablonu, un DNS polimerāze sāk tam komplementāru nukleotīdu iekļaušanu. Kad nukleotīdi apvienojas (nukleīnskābju polimerizācija), tas atbrīvo pirofosfāta (divas kopā savienotas fosfātu grupas) grupas un enerģiju. Katrs nukleotīda pievienojums atbrīvo ekvimolāru daudzumu pirofosfāta. Pirofosfāts pārvēršas ATP ar ATP sulfurilāzes palīdzību substrāta APS klātbūtnē. Izveidotais ATP veicina luciferīna starpniecību notiekošo luciferīna pārveidošanu par oksiuciferīnu, radot redzamu gaismu daudzumos, kas ir proporcionāli ATP daudzumam. Gaismu uztver ar fotonu noteikšanas ierīci vai ar fotopavairotāju un izveido pirrogrammu. Apirāze noārda ATP un neiesaistītos dNTP reakcijas maisījumā. dNTP pievienošana tiek veikta vienlaicīgi. Tā kā pēc gaismas iestrādes un noteikšanas ir zināma nukleotīda pievienošana, var noteikt šablona secību. Parauga DNS nukleotīdu secības ģenerēšanai izmanto pyrogrammu, kā parādīts 03. attēlā.

Pirozequencing ir ļoti svarīga atsevišķu nukleotīdu polimorfisma analīzē un īsu DNS posmu secībā. Augsta precizitāte, elastība, automatizācijas vienkāršība un paralēla apstrāde ir pirosequencing priekšrocības salīdzinājumā ar Sanger secības paņēmieniem.

03. attēls. Pirosequencing

Kāda ir atšķirība starp Sanger sekvencēšanu un Pyrosequencing?

Sanger sekvencēšana vs pirosequencing
Sangera sekvencēšana ir DNS secības metode, kuras pamatā ir ddNTPs selektīva inkorporācija ar DNS polimerāzi un ķēdes izbeigšana.	Pirozequencing ir DNS secības noteikšanas metode, kuras pamatā ir pirofosfāta izdalīšanās noteikšana pēc nukleotīda iestrādes.
DdNTP izmantošana
ddNTPs tiek izmantoti, lai pārtrauktu DNS replikāciju	ddNTP netiek izmantoti.
Iesaistītie fermenti
Tiek izmantota DNS polimerāze.	Tiek izmantoti četri fermenti: DNS polimerāze, ATP sulfurilāze, luciferāze un apirāze.
Izmantotās substrāti
APS un Luciferin netiek izmantoti.	Tiek izmantoti adenozīna 5 ’fosfosulfāti (APS) un luciferīns.
Maksimālā temperatūra
Tas ir lēns process.	Tas ir ātrs process.

Kopsavilkums - Sanger sekvencēšana vs pirosequencing

Sangera sekvencēšana un pirosekvenēšana ir divas DNS secības noteikšanas metodes, ko izmanto molekulārajā bioloģijā. Sangera secība konstruē nukleotīdu secību secībā, pārtraucot ķēdes pagarinājumu, savukārt pirosekvenēšana konstruē precīzu nukleotīdu secību secībā, iestrādājot nukleotīdus un atklājot pirofosfātu izdalīšanos. Tāpēc galvenā atšķirība starp Sangera sekvencēšanu un pirosequencing ir tā, ka Sanger sekvencēšana darbojas ar sekvencēšanu ar ķēdes izbeigšanu, savukārt pirosequencing darbojas ar secēšanu ar sintēzes palīdzību.

Atsauce:
1. Fakruddins, Md un Abhijits Chowhury. “Pirosequencing - alternatīva tradicionālajai Sanger secībai.” Amerikas bioķīmijas un biotehnoloģijas žurnāls. Zinātniskās publikācijas, 2012. gada 2. marts. Tīmeklis. 2017. gada 28. februāris.
2. “Sanger secība”. Sangera secība - ScienceDirect tēmas. N.p., n.d. Web. 2017. gada 28. februāris

Attēla pieklājība:
1. Chrideph Goemans (modifiziert) “Didesoksi-metode” - Dr Norman Mauder, auf Basin einer Datei von Christoph Goemans (CC BY-SA 3.0), izmantojot Commons Wikimedia
2. “Sanger-DNA-seq” Autors Enzo poļu valodas Vikipēdijā (CC BY-SA 3.0), izmantojot Commons Wikimedia
3. “Pirosequencing”, izmantojot mikrobioloģiskos baitus (CC BY-SA 2.0), izmantojot Flickr