Atšķirība starp RT PCR un QPCR

Galvenā atšķirība - RT PCR vs QPCR
 

Polimerāzes ķēdes reakcija ir paņēmiens, ko izmanto, lai pastiprinātu noteiktu DNS reģionu in vitro. Sakarā ar to, ka Kerijs Mullis 1983. gadā izgudroja šo paņēmienu, zinātnieki pētniecības vajadzībām var izgatavot no tūkstošiem līdz miljoniem eksemplāru īpašu DNS fragmentu. Pašlaik tā ir kļuvusi par parastu un ikdienišķu paņēmienu klīniskās un pētniecības laboratorijās visdažādākajiem pielietojumiem. Pastāv tradicionālās PCR tehnikas variācijas, piemēram, RT PCR, ligzdota PCR, daudzkārtīga PCR, Q PCR, RT - QPCR utt., RT PCR un Q PCR ir divas svarīgas PCR variācijas. Galvenā atšķirība starp RT PCR un Q PCR ir tā RT PCR izmanto gēnu ekspresijas noteikšanai, izveidojotpapildinošā DNS (cDNS) transkripti no RNS kamēr Q PCR izmanto, lai kvantitatīvi izmērītu PCR produktus reāllaikā, izmantojot fluorescējošas krāsvielas.

SATURS
1. Pārskats un galvenās atšķirības
2. Kas ir RT PCR
3. Kas ir QPCR
4. Blakus salīdzinājums - RT PCR pret QPCR
5. Kopsavilkums

Kas ir RT PCR?

Reversās transkripcijas polimerāzes ķēdes reakcija (RT PCR) ir PĶR variants, ko izmanto RNS ekspresijas noteikšanai. Tā ir ļoti svarīga metode mRNS ekspresijas noteikšanai audos. RT PCR izmanto, ja parauga izejmateriāls ir RNS. RT PCR laikā matricas mRNS vispirms tiek pārveidots par komplementāru DNS. Šo darbību katalizē enzīma reversā transkriptāze, un šo procesu sauc par reverso transkripciju. Otrkārt, tikko sintezētai cDNS amplifikācijai izmanto tradicionālo PCR.

RT PCR ir ļoti jutīga metode, kurai nepieciešams samērā neliels daudzums RNS parauga. RT PCR parasti izmanto RNS sugu, īpaši RNS vīrusu, piemēram, cilvēka imūndeficīta vīrusa un C hepatīta, diagnosticēšanai un kvantitatīvai noteikšanai.

01. attēls: RT PCR tehnika

Kas ir QPCR?

Kvantitatīvā PCR (QPCR) ir PCR variants, ko izmanto PCR produktu kvantitatīvai mērīšanai. To sauc arī par reāllaika polimerāzes ķēdes reakciju, jo tā mēra reālā laika pastiprinājumu, izmantojot reālā laika PCR mašīnu. Tā ir piemērota metode mērķa sekvences vai gēna daudzuma noteikšanai paraugā. Interesanta QPCR iezīme ir tā, ka tas apvieno gan pastiprināšanu, gan patieso skaitlisko noteikšanu vienā solī. Tādēļ nepieciešamību pēc gela elektroforēzes noteikšanā var novērst ar QPCR metodi. QPCR izmanto fluorescējošas krāsvielas, lai marķētu PCR produktus PCR reakciju laikā, kas galu galā noved pie tiešas kvantitatīvās noteikšanas. Kad PCR produkti uzkrājas, tiek uzkrāti arī dienasgaismas signāli, un to mērīs reālā laika mašīna. QPCR var kombinēt ar RT PCR. To sauc par RT-QPCR vai QRT-PCR, un to uzskata par visspēcīgāko, jutīgāko un kvantitatīvāko metodi RNS līmeņa noteikšanai šūnās vai audos..

SYBR Green un Taqman ir divas metodes, ko izmanto, lai noteiktu vai skatītu reālā laika PCR amplifikācijas procesu. SYBR Green metodi veic, izmantojot fluorescējošu krāsvielu, ko sauc par SYBR green, un nosaka amplifikāciju, saistot krāsu, iegūstot divpavedienu DNS. Taqman veic, izmantojot divkārši iezīmētas zondes, un nosaka amplifikāciju, zondei noārdoties ar Taq polimerāzi, un fluorofora izdalījumiem, kā parādīts 02. attēlā. Abas metodes uzrauga amplifikācijas procesa gaitu un reālā laikā ziņo par produkta daudzumu..

Reālā laika PCR ir plašs lietojumu klāsts, piemēram, gēnu ekspresijas kvantitatīva noteikšana, mikroRNS un nekodēta RNS analīze, SNP genotipēšana, kopiju skaita variantu noteikšana, retu mutāciju noteikšana, ģenētiski modificētu organismu noteikšana, infekcijas izraisītāju noteikšana utt..

02. Attēls. Kvantitatīvā PCR metode

Kāda ir atšķirība starp RT PCR un QPCR?

RT PCR vs QPCR
RT PCR ir paņēmiens, ko izmanto gēnu ekspresijas noteikšanai ar amplifikācijas palīdzību.	QPCR ir paņēmiens, kas pastiprina DNS un reālā laikā nosaka PCR produktus.
Reversās transkriptāzes enzīma iesaistīšana
RT PCR izmanto fermenta reverso transkriptāzi.	Enzīma reverso transkriptāzi QPCR neizmanto.
Fluorescējoši marķētu molekulu izmantošana
RT PCR neizmanto fluorescējoši marķētas krāsvielas vai zondes.	QPCR izmanto fluorescējoši marķētas krāsvielas vai zondes.
PCR produkta kvantitatīvā noteikšana
RT PCR neizsaka PCR produkta daudzumu, ja tas nav savienots ar QPCR.	QPCR kvantitatīvi izmēra PCR produktu.
Izejmateriāls
Izejmateriāls ir mRNS.	Izejmateriāls ir DNS.
CDNS sintēze
Papildu DNS tiek iegūts RT PCR laikā.	Papildu DNS netiek ražots QPCR laikā.

Kopsavilkums - RT PCR vs QPCR

RT PCR un QPCR ir divas tradicionālās PCR versijas. RT PCR paņēmiens tiek veikts mRNS paraugiem, un to virza ar reverso transkripciju un cDNS ražošanu. QPCR izmanto, lai kvantitatīvi noteiktu PCR produktus reālā laika PCR termiskajos ciklos, izmantojot fluorescējošas krāsvielas vai marķētas zondes. QPCR PCR produkta daudzumu attēlo parauga izstarotie fluorescējošie signāli. RT PCR tiek plaši izmantots kā pastiprināšanas process, savukārt QPCR parasti izmanto kā kvantitatīvo noteikšanas procesu. Šī ir atšķirība starp RT PCR un QPCR.

Atsauces:
1. Deepak, SA, KR Kottapalli, R. Rakwal, G. Oros, KS Rangappa, H. Iwahashi, Y. Masuo un GK Agrawal. “Reālā laika PCR: revolucionāra gēnu noteikšana un ekspresijas analīze.” Pašreizējā genomika. Bentham Science Publishers Ltd., 2007. gada jūnijs. Tīmeklis. 2017. gada 3. aprīlis
2. Zeka, Fjoralba, Katriena Vanderheyden, Els De Smet, Claude A. Cuvelier, Pieter Mestdagh un Jo Vandesompele. “Vienkārša un jutīga FFPE paraugu gēnu ekspresijas analīze, kas balstīta uz RT-qPCR.” Dabas ziņas. Dabas izdevēju grupa, 2016. gada 22. februāris. Web. 2017. gada 3. aprīlis
3. Overbergs, L., A. Giulietti, D. Valckx, B. Decallonne, R. Bouillon un C. Mathieu. “Reāllaika reversās transkriptāzes PCR izmantošana citokīnu gēnu ekspresijas kvantitatīvai noteikšanai.” Biomolekulāro metožu žurnāls: JBT. Biomolekulāro resursu kompleksa asociācija, 2003. gada marts. Tīmeklis. 2017. gada 3. aprīlis

Attēla pieklājība:
1. Lietotājs “Taqman”: Braindamaged - sākotnējā augšupielādētāja (Public Domain) paša darbs, izmantojot Commons Wikimedia
2. “Reversās transkripcijas polimerāzes ķēdes reakcija”, autors Jpark623 - Savs darbs (CC BY-SA 3.0), izmantojot Commons Wikimedia